II. La conservation des molécules d'ADN

Déroulement général

1. t0 (9 novembre 2017, 16h35-17h35): Extraction et observation de l’ADN de l’échantillon de kiwi témoin
2. Exposition d’échantillons à différents paramètres extérieurs
3. t1 (23 novembre 2017, 16h35-17h35) : Extraction et observation de l’ADN des échantillons soumis aux différents paramètres extérieurs
4. t2 (7 décembre 2017, 16h35-17h35) : idem
5. t3 (21 décembre 2017, 16h35-17h35) : idem
6. Interprétation des résultats

 

Paramètres extérieurs d’exposition des échantillons

1. à l’air libre
2. dans un liquide aseptisant
3. dans du vinaigre d’alcool (acide)
4. dans de l’eau riche en minéraux
5. à -20°C (congélateur)

 

Matériel

• 16 morceaux de kiwis (3 prélèvements par paramètre extérieur (3 x 5) + 1 prélèvement au t0 pour le témoin)
• 4 pots en verre + 1 sac plastique
• 3 masques
• 3 paires de gants
• 1 solution de NaCl (chlorure de sodium) à 60 g/L
• 1 solution de détergent
• 1 solution d’éthanol à 90° maintenue dans la glace
• 1 pipette (pour détergent)
• 5 mortier + pilon
• 5 éprouvette de 50 mL
• 5 spatule longue
• 5 bécher
• 5 erlenmeyer
• 5 entonnoir + papier filtre
• 5 agitateur manuel
• 1 microscope optique
• 1 appareil photographique

 

Protocole

 

t0 : Découper 16 morceaux de kiwi. Procéder à l’extraction de l’ADN pour 1 des morceaux (témoin : t0). Placer 3 morceaux dans chacun des 4 pots et 3 morceaux dans le sac plastique et soumettre chaque récipient à un des 5 paramètres extérieurs.

 

t1 (t0 + 2 semaines) : Prélever un morceau de kiwi par milieu et procéder aux 5 extractions d’ADN.

 

t2 (t0 + 4 semaines) : Prélever un morceau de kiwi par milieu et procéder aux 5 extractions d’ADN.

 

t3 (t0 + 6 semaines) : Prélever un morceau de kiwi par milieu et procéder aux 5 dernières extractions d’ADN.

 

 

Extraction de l’ADN

 

Couper l’échantillon en petits morceaux puis les broyer dans le mortier à l’aide du pilon. Transférer le tout dans un bécher.

 

Ajouter, à l’aide de l’éprouvette, 40 mL de solution de NaCl à 60 g/L, puis 15 gouttes de solution détergente avec la pipette.

 

Mélanger doucement à l’aide de la spatule pendant environ 20 secondes.

 

Filtrer le contenu du bécher sur du papier filtre, et récupérer le filtrat dans l’Erlenmeyer. Presser légèrement et très délicatement le filtre pour récupérer un maximum de filtrat.

 

Homogénéiser doucement le contenu de l’Erlenmeyer, puis transférer 10 mL de ce filtrat dans l’éprouvette. Ajuster ensuite le volume jusqu’à 40 mL avec la solution froide d’éthanol à 90° très délicatement et lentement.

 

Laisser reposer quelques minutes.

 

Retirer doucement l’ADN avec l’agitateur.

 

Poser l’ADN sur la lame microscopique.

 

Observer au microscope et photographier l’observation.

       L’échantillon à l’air libre s’est très dégradé après une semaine d’exposition : il s’est dégradé trop vite pour pouvoir conserver de l’ADN au bout des 6 semaines d’exposition. En outre, des champignons se sont développés sur le morceau de kiwi. Ces êtres vivants peuvent contaminer le prélèvement lors de l’extraction d’ADN. Seuls les autres milieux seront alors étudiés.

 

     L’observation au microscope n’apporte aucune information fiable sur l’état de l’ADN. Nous nous contenterons donc de l’étude des photographies macroscopiques.

 

       Lorsqu’il est en présence importante d’eau liquide, l’ADN est très fortement dégradé après deux semaines seulement. Cela est dû à l’action d’enzymes appelés nucléases qui coupent les liaisons phosphodiester de l’ADN mais ne peuvent agir qu’en présence de molécules d’eau. On appelle cette réaction hydrolyse enzymatique.

 

       L’ADN est également dégradé lorsqu’il se trouve en milieu acide, même si cette dégradation est moindre que dans l’eau. L’hydrolyse chimique en est la cause. Elle est semblable à l’hydrolyse enzymatique mais l’acidité remplace l’action des enzymes. L’hydrolyse alcaline, qui a lieu dans des pH basiques, ne concerne que l’ARN car l’ADN y résiste très bien.

 

     L’action destructive des bactéries est réduite dans le gel hydroalcoolique puisqu’il a une propriété aseptisante. C’est pourquoi l’ADN y est particulièrement bien conservé.

 

       L’ADN est presque parfaitement conservé à une température de - 20 °C. Ceci est dû à l’absence d’eau liquide permettant l’hydrolyse.

 

    On en conclut que différents facteurs influencent la conservation de l’ADN. En outre, l’effet conservateur de certains facteurs (comme un milieu basique à basse température) se cumule, ce qui augmente la qualité de l’ADN fossile extrait.