IV. Séquençage

DÉFINITIONS :

La Taq polymérase est un ADN polymérase thermostable, c’est-à-dire un complexe enzymatique qui permet la synthèse d’ADN  et ayant une forte résistance aux changements de température. 

Un désoxyribonucléotide (dNTP), unité élémentaire de l’ADN, est composé d’une base nucléique, d’un résidu désoxyribose et d’un groupe phosphate. Il en existe 4, un par base nucléique (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

Un didésoxynucléotide (ddNTP) est un dNTP chimiquement modifié tel que la liaison avec le nucléotide suivant est impossible. L’incorporation d’un ddNTP par la Taq polymérase interrompt donc la chaîne.

Le plasmide est une molécule d’ADN circulaire aux propriétés particulières.

Un brin d’ADN a une extrémité 5’ et une extrémité 3’, situées à l’opposée de celles de son brin complémentaire. Le sens de synthèse est de 5’ vers 3’.

Une amorce correspond à une suite de 15 à 25 nucléotides.

FONCTIONNEMENT :

Amplification in vivo (par des bactéries dans lesquelles on introduit le fragment d’ADN intégré dans un plasmide)

Mélange réactionnel (1 éprouvette par didésoxynucléotide) : l’ADN matrice (dénaturée), des amorces (complémentaires à l’extrémité 5’ du plasmide), une Taq polymérase, les 4 désoxyribonucléotides et un des 4 didésoxynucléotides, en très faible concentration et marqué d’un fluorochrome de spectre d'émission spécifique au ddNTP. Il faut qu’un ddNTP soit statistiquement incorporé à toutes les positions possibles.

1) Hybridation de l’amorce (50°C) : elle se fixe sur l’extrémité 3’ de la séquence à étudier.

2) Polymérisation : à 60°C, l’ADN polymérase effectue la polymérisation à partir de l’extrémité 3’ de l’amorce, dans le sens de synthèse. La polymérisation s'arrête dès l’incorporation (aléatoire) d’un didésoxynucléotide. 

3) Dénaturation (96°C) du fragment d’ADN synthétisé.

Ce cycle est répété dans les 4 éprouvettes un grand nombre de fois.

Séparation par électrophorèse (l’ADN étant chargée négativement) sur un gel de poly-acrylamide qui ralentit plus les fragments plus longs avec une très bonne résolution ; plus un fragment est long plus il sera donc proche de l’électrode négative.

Analyse spectrale de différenciation des fluorochromes et association au ddNTP correspondant.

Détermination de la séquence d’ADN : On connaît la longueur des fragments et la nature de leur extrémité, ce qui permet de déterminer la séquence de l’ADN matrice (la séquence obtenue par l’électrophorèse est complémentaire à celle de l’ADN matrice).

1 kb (1000 bases) par lecture de 6 à 8 heures